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如何對血清、腹水、培養(yǎng)物上清液等來源的抗體樣品進行預(yù)處理?經(jīng)常用的預(yù)處理方法是沉淀法。對于腹水中的脂蛋白,常用硫酸右旋葡糖酐沉淀,或是在pH=7時,采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上樣時若腹水樣品太粘稠可以使用上樣緩沖液稀釋樣品。對于白蛋白等雜蛋白,可以使用分級沉淀法去除,如硫酸銨沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脫鹽柱或透析可以除去鹽離子并更換緩沖液。純化不與Protein A或G結(jié)合的IgM、IgY該怎么選擇填料?(1)通常采用沉淀法結(jié)合凝膠過濾法純化IgM,但對于大量純化抗體,這種方案繁瑣且產(chǎn)量低。(2)采用Protein L親和填料,特異性的結(jié)合κ輕鏈,對純化抗體片段及完整地抗體IgG、IgM和IgA很有用。(3)嗜硫填料是根據(jù)其配基與抗體間的二硫鍵產(chǎn)生特異性相互作用,中性條件下吸附、洗脫,純化后蛋白活性高,是一種通用型抗體純化手段。怎么純化抗體Fab 片段?(1)Protein L可以特異性的結(jié)合抗體的κ輕鏈,因此,只要Fab 片段中含有κ輕鏈,就可以選擇Protein L填料進行純化。(2)Protein G 除了可以特異性結(jié)合IgG 的Fc 片段,還可以特異性低親和的與某些抗體Fab片段結(jié)合。(3)Protein A只結(jié)合IgG的Fc片段。采用流穿模式,將純的IgG酶解后過Protein A填料,F(xiàn)ab在流穿峰,F(xiàn)c片段結(jié)合在填料上。如何提高抗體回收率?(1)更換親和力更高的填料。(2)對于Protein A填料,結(jié)合pH可以升至8-9。(3)填料多次使用后殘留物增多,載量降低,建議用6M鹽酸胍或70%乙醇清洗填料。對于耐堿填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。為什么洗脫液中沒有正確條帶?(1)首先看樣品是否結(jié)合,抗體種屬亞型與親和填料是否有親和力,結(jié)合緩沖液pH是否中性,流穿中抗體是否有減少,可將原始樣品和流穿同時跑SDS-PAGE電泳進行分析。(2)再看樣品是否與填料結(jié)合太牢固,沒有洗脫下來,建議用pH更低的緩沖液洗脫。(3)洗脫后酸性條件下抗體是否水解,可在收集管中預(yù)先加入中和液或精氨酸等保護劑,或者選擇能在近中性條件下洗脫的填料。洗脫后抗體純度不高怎么辦?(1)洗雜是否全部?可取最后洗雜液跑SDS-PAGE電泳進行分析。(2)適當提高結(jié)合時鹽離子濃度,或在洗雜液中加入低濃度的非離子型去垢劑,降低非特異性吸附。(3)上樣前樣品預(yù)處理,除去部分雜質(zhì)。(4)采用兩步純化,先親和層析純化,后經(jīng)離子交換層析,除去HCP 、脫落的 Protein A以及部分聚體等等,得到純度更高的抗體。體外培養(yǎng)表達IgG,如何避免培養(yǎng)基中如小牛血清IgG干擾?(1)血清可先用Protein G預(yù)處理,在培養(yǎng)前除去IgG?;蜻x用IgG含量較低的血清。(2)樣品先用Protein A或G純化,得到的抗體再經(jīng)過疏水層析除去牛IgG。
經(jīng)常用的預(yù)處理方法是沉淀法。對于腹水中的脂蛋白,常用硫酸右旋葡糖酐沉淀,或是在pH=7時,采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上樣時若腹水樣品太粘稠可以使用上樣緩沖液稀釋樣品。對于白蛋白等雜蛋白,可以使用分級沉淀法去除,如硫酸銨沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脫鹽柱或透析可以除去鹽離子并更換緩沖液。
(1)通常采用沉淀法結(jié)合凝膠過濾法純化IgM,但對于大量純化抗體,這種方案繁瑣且產(chǎn)量低。(2)采用Protein L親和填料,特異性的結(jié)合κ輕鏈,對純化抗體片段及完整地抗體IgG、IgM和IgA很有用。(3)嗜硫填料是根據(jù)其配基與抗體間的二硫鍵產(chǎn)生特異性相互作用,中性條件下吸附、洗脫,純化后蛋白活性高,是一種通用型抗體純化手段。
(1)Protein L可以特異性的結(jié)合抗體的κ輕鏈,因此,只要Fab 片段中含有κ輕鏈,就可以選擇Protein L填料進行純化。(2)Protein G 除了可以特異性結(jié)合IgG 的Fc 片段,還可以特異性低親和的與某些抗體Fab片段結(jié)合。(3)Protein A只結(jié)合IgG的Fc片段。采用流穿模式,將純的IgG酶解后過Protein A填料,F(xiàn)ab在流穿峰,F(xiàn)c片段結(jié)合在填料上。
(1)更換親和力更高的填料。(2)對于Protein A填料,結(jié)合pH可以升至8-9。(3)填料多次使用后殘留物增多,載量降低,建議用6M鹽酸胍或70%乙醇清洗填料。對于耐堿填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。
(1)首先看樣品是否結(jié)合,抗體種屬亞型與親和填料是否有親和力,結(jié)合緩沖液pH是否中性,流穿中抗體是否有減少,可將原始樣品和流穿同時跑SDS-PAGE電泳進行分析。(2)再看樣品是否與填料結(jié)合太牢固,沒有洗脫下來,建議用pH更低的緩沖液洗脫。(3)洗脫后酸性條件下抗體是否水解,可在收集管中預(yù)先加入中和液或精氨酸等保護劑,或者選擇能在近中性條件下洗脫的填料。
(1)洗雜是否全部?可取最后洗雜液跑SDS-PAGE電泳進行分析。(2)適當提高結(jié)合時鹽離子濃度,或在洗雜液中加入低濃度的非離子型去垢劑,降低非特異性吸附。(3)上樣前樣品預(yù)處理,除去部分雜質(zhì)。(4)采用兩步純化,先親和層析純化,后經(jīng)離子交換層析,除去HCP 、脫落的 Protein A以及部分聚體等等,得到純度更高的抗體。
(1)血清可先用Protein G預(yù)處理,在培養(yǎng)前除去IgG?;蜻x用IgG含量較低的血清。(2)樣品先用Protein A或G純化,得到的抗體再經(jīng)過疏水層析除去牛IgG。
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